실험방법

1) 균수측정 - 검체 25 g 또는 25 mL를 채취 후, 225 mL의 희석액을 가하여 1~2분간 저속으로 균질화하여 시험용액을 준비 후 10배 단계 희석액을 만듬

2) 균수측정 - 시험용액 및 단계별 희석액 1 mL씩을 2매 이상의 멸균 Petri Dish에 분주하고, 43～45℃로 유지한 난황을 첨가하지 않은 Perfringens Agar Base 10∼15 mL를 가하여 좌우로 돌리면서 잘 혼합한 후 응고

3) 균수측정 - 응고된 배지 위에 다시 동일한 배지 10 mL를 가하여 중첩시킨 후 35∼37℃에서 24±2 시간 혐기 배양. 150개 이하의 전형적인 검은색 집락이 확인된 평판을 선별하여 각 집락수를 계수

4) 확인시험 - 계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 2장의 Nutrient Agar에 접종하고 35∼37℃ 에서 18∼24 시간 각각 혐기배양, 호기배양 진행

5) 확인시험 - 혐기배양한 1장은 그람염색을 실시. 호기배양 진행한 또 다른 1장은 균의 비발육을 확인

6) 확인시험 - 그람양성간균으로 확인된 집락은 glucose, lactose, inositol, raffinose를 1% 가한 4종의 GAM 배지에 옮겨 35∼37℃에서 3일간 배양 후 BTB-MR Solution을 가해서 붉은 색으로 변하는 것을 양성으로 판정

7) 확인시험 - 운동성은 GAM 배지에서 35∼37℃에서 1～2일간 배양하여 유무를 관찰

6) 확인시험 - Glucose, lactose, inositol과 raffinose를 분해하며 운동성이 없는 것을 확인하면 Lecithinase 억제시험을 실시

8) 확인시험 - 난황 첨가 Perfringens Agar Base에 접종하여 35∼37℃에서 24시간 혐기배양한 후 2～4 mm의 불투명한 환을 가지는 황회색 집락을 양성으로 판정

9) 균수계산 - 확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산. 예를 들어, 10-4에서 평균집락수 85개이었고, 이 중 5개의 집락을 확인한 결과 4개의 집락이 클로스트리디움 퍼프린젠스로 동정되었을 경우 85×(4/5)×10,000=680,000으로 계산